Przełom w transplantologii: NMP i anakinra w przeszczepianiu nerek

Czy NMP zmienia oblicze transplantologii?

Normotermiczna perfuzja maszynowa (NMP) reprezentuje ważny postęp w transplantologii, oferując możliwość poprawy funkcji przeszczepianych narządów i zwiększenia ich wykorzystania. Technologia ta, przywracając krążenie i metabolizm w narządzie przy użyciu natlenowanego roztworu na bazie krwi, stwarza unikalne możliwości podawania ukierunkowanych terapii przed transplantacją. Mimo licznych badań nad różnymi metodami leczenia, niewiele z nich doprowadziło do klinicznego zastosowania NMP jako urządzenia do interwencji terapeutycznych.

Jednym z potencjalnych celów interwencji jest układ inflammasomu i receptora interleukiny 1 (IL-1α/IL-1β/IL-1R1), który odgrywa kluczową rolę w procesach zapalnych podczas niedokrwienno-reperfuzyjnego uszkodzenia nerek. IL-1α i IL-1β, wiążąc się z IL-1R1, aktywują czynniki transkrypcyjne, w tym jądrowy czynnik kappa B (NF-κB), co prowadzi do produkcji cytokin prozapalnych i inicjacji apoptozy. Anakinra, rekombinowany ludzki antagonista receptora IL-1 (IL-1RA) składający się ze 153 reszt aminokwasowych, konkurencyjnie hamuje wiązanie IL-1α i IL-1β do IL-1R1, zapobiegając kaskadzie jałowego zapalenia i tworzeniu inflammasomu NLRP3. Lek ten, zarejestrowany w leczeniu chorób autoimmunologicznych, w tym reumatoidalnego zapalenia stawów, może potencjalnie łagodzić uszkodzenia nerek związane z transplantacją.

Jak przeprowadzono badanie NMP?

W przeprowadzonym badaniu oceniano fizjologiczne i molekularne efekty blokady IL-1R przy użyciu anakinry podczas ex vivo NMP nerek świńskich. Nerki poddawano 15-minutowemu niedokrwieniu in situ, następnie 2-godzinnemu przechowywaniu w zimnie i 4-godzinnemu okresowi NMP z użyciem perfuzatu na bazie krwi. Pary nerek od tego samego zwierzęcia (n=10 nerek) były losowo przydzielane do grupy otrzymującej anakinrę (50 mg) lub kontrolnej (0,5 ml 0,9% chlorku sodu) podawanej jako bolus tętniczy na początku NMP. Dawkę anakinry dobrano tak, aby zapewnić maksymalne wysycenie w tym modelu ex vivo.

Badania przeprowadzono na pięciu świniach rasy landrace o wadze 40-45 kg, które poddano znieczuleniu ogólnemu i laparotomii w linii środkowej. Po wypreparowaniu obu szypuł nerkowych i podaniu 25 000 j.m. heparyny, tętnice i żyły nerkowe podwiązano na 15 minut, aby wywołać krótkotrwałe niedokrwienie ciepłe. Następnie nerki usunięto i przepłukano 500 ml zimnego roztworu konserwującego University of Wisconsin (UW) przy ciśnieniu hydrostatycznym 100 cmH₂O. Nerki umieszczono w workach zawierających zimny roztwór UW i przetransportowano do laboratorium perfuzyjnego. Od zwierzęcia-dawcy pobrano litr krwi do dwóch worków z antykoagulantem CPDA.

Po wyjęciu z zimnego przechowywania (2 h) nerki zważono i przygotowano do NMP. Kaniulowano tętnicę nerkową, żyłę i moczowód, a nerkę przepłukano 200 ml zimnego roztworu Ringera, aby usunąć roztwór konserwujący o wysokim stężeniu potasu. NMP przeprowadzono przy użyciu obwodu perfuzyjnego opartego na technologii krążenia pozaustrojowego i natlenowania pozaustrojowego przy użyciu Medtronic Bioconsole 560. Obwód ex vivo wypełniono 300 ml roztworu Ringera z dodatkiem 2,5 g mannitolu, 15 ml 8,4% wodorowęglanu sodu i 3000 j.m. heparyny. Następnie dodano 300 ml krwi autologicznej i recyrkulowano do osiągnięcia temperatury 37,4°C. Roztwór na bazie krwi cyrkulował przez nerkę przez tętnicę nerkową przy średnim ciśnieniu tętniczym 85 mmHg. Roztwór odżywczy (Synthamin 17 10%) z dodatkiem 15 ml 8,4% wodorowęglanu sodu i 100 j.m. insuliny infundowano z szybkością 20 ml/h, 5% glukozę z szybkością 5 ml/h, a roztwór Ringera stosowano do zastąpienia produkcji moczu ml za ml. Perfuzat na bazie krwi był natlenowany przez oksygenator membranowy wbudowany w obwód przy przepływie 95% tlenu/5% dwutlenku węgla 0,1 l/min. Kreatynina była infundowana do ramienia tętniczego obwodu, aby utrzymać średnie stężenie krążące 2000 μmol/l. NMP prowadzono przez 4 godziny, a przepływ krwi nerkowej rejestrowano w sposób ciągły przez cały ten okres.

Jakie są efekty działania anakinry podczas NMP?

Wyniki badania wykazały, że anakinra nie wpłynęła na parametry hemodynamiczne ani funkcjonalne nerek podczas NMP. Przepływ krwi nerkowej, produkcja moczu, klirens kreatyniny i frakcyjna ekskrecja sodu pozostały na podobnym poziomie w obu grupach. Jednak na poziomie molekularnym zaobserwowano istotne zmiany. Anakinra znacząco zmniejszyła ekspresję IL-6, ICAM-1 (cząsteczki adhezji międzykomórkowej 1) i ligandu Fas w korze nerki w porównaniu z nerkami kontrolnymi (p=0,029, 0,029, 0,028 odpowiednio). Nie miała natomiast istotnego wpływu na ekspresję IL-1β ani IL-8.

Próbki perfuzatu i moczu pobierano bezpośrednio przed rozpoczęciem NMP i co godzinę po tym. Próbki wysyłano do rutynowej analizy hematologicznej i biochemicznej, w tym mocznika i elektrolitów. Dodatkowe porcje perfuzatu i moczu przechowywano do dalszych analiz w temperaturze -80°C. Klirens kreatyniny obliczano jako iloczyn kreatyniny w moczu (μmol/l) i objętości moczu (ml) podzielony przez kreatyninę w osoczu (μmol/l). Frakcyjne wydalanie sodu (FENa) obliczano jako iloczyn sodu w moczu i kreatyniny w osoczu podzielony przez iloczyn sodu w osoczu i kreatyniny w moczu. Biopsje kory nerkowej wykonywano przed rozpoczęciem 15-minutowego okresu ciepłego niedokrwienia (wartość wyjściowa) i na końcu 4-godzinnego okresu NMP.

Poziomy krążącej anakinry w perfuzacie, mierzone metodą ELISA, były wykrywalne tylko w leczonych nerkach i zmniejszały się w sposób w przybliżeniu liniowy w ciągu 4 godzin NMP. Po 4 godzinach poziomy IL-1RA były niemal niewykrywalne. Nie zaobserwowano statystycznie istotnych różnic między poziomami IL-1α, IL-6, TNFα, IL-8 i IL-10 w perfuzacie między nerkami leczonymi anakinrą a kontrolnymi. Poziomy IL-1β nie były wykrywalne w żadnej z grup.

Komórki nabłonka kanalików proksymalnych są szczególnie podatne na uszkodzenia niedokrwienne, co prowadzi do wysokich poziomów cytokin zapalnych wydzielanych do moczu. Zaobserwowano znaczące zmniejszenie poziomu IL-6 w moczu w grupie anakinry w porównaniu z kontrolą (p=0,009). Nie stwierdzono statystycznie istotnych różnic w poziomach IL-1α, TNFα, IL-8 i IL-10 w moczu między grupami.

Jak zmieniają się reakcje molekularne nerek?

Do zbadania zmian w ekspresji genów w nerkach leczonych anakinrą w porównaniu z nerką kontrolną wykorzystano qPCR. Biopsje przechowywano w roztworze RNAlater do utrwalania. Tkankę lizowano i ekstrahowano RNA. RNA wykorzystano do wygenerowania cDNA dla każdej próbki poprzez odwrotną transkrypcję. Zaprojektowano primery dla angiopoetyny 1, ligandu Fas, HPRT1, ICAM-1, IL-1β, IL-6 i IL-8. HPRT1, gen referencyjny, koduje białko hypoksantyna-guanina fosforybozylotransferazę (HGPRT), enzym zaangażowany w syntezę puryn. Względny RT-PCR przeprowadzono przy użyciu SYBR Green na wszystkich próbkach nerek dla każdego genu w trzech powtórzeniach. Analizy przeprowadzono przy użyciu metody 2^(-ΔΔCt) między grupami anakinry i kontrolną po 4 h NMP i na początku w poszczególnych nerkach.

Wiązanie IL-1R1 prowadzi do aktywacji różnych czynników transkrypcyjnych związanych z apoptozą, w tym NF-κB i MyD88. Liczba komórek apoptotycznych w korze nerki, mierzona barwieniem TUNEL, była stosunkowo niska we wszystkich nerkach, ale znacząco wzrosła podczas NMP. Anakinra nie zmniejszyła istotnie liczby komórek apoptotycznych (p=0,935). Aby zbadać wpływ anakinry na apoptozę, skrawki zatopionej w parafinie kory nerkowej, pobrane na początku i po 4 godzinach NMP, barwiono techniką TUNEL i wizualizowano przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego. Wykonano dziesięć różnych pól widzenia przy powiększeniu 40x w długościach fal DAPI i FITC dla każdego pola widzenia i zliczono liczbę komórek pozytywnych.

Czy można zastosować anakinrę w klinicznej praktyce?

Badanie przeprowadzono na modelu stosunkowo łagodnego uszkodzenia nerki, które byłoby odwracalne. Nawet w tych warunkach wcześniejsze badania wykazały, że kombinacja 15-minutowego czasu ciepłego i 2-godzinnego przechowywania w zimnie zmniejszała klirens kreatyniny w porównaniu z 2-godzinnym przechowywaniem w zimnie po zerowym czasie ciepłego niedokrwienia. W tym modelu, chociaż anakinra nie poprawiła klirensu kreatyniny, przepływu krwi nerkowej ani produkcji moczu podczas NMP w porównaniu z kontrolą, wykazano nie-niższość, co dostarcza wstępnych danych dotyczących bezpieczeństwa podawania anakinry podczas NMP jako nowego systemu dostarczania leków.

W badaniu wybrano bolus anakinry 50 mg, aby zapewnić średnie stężenie w osoczu wynoszące 141 μg/ml. Ten poziom docelowy był podobny do tego w badaniu u ludzi badającym optymalne stężenie anakinry w osoczu w celu przenikania do płynu mózgowo-rdzeniowego w celu hamowania odpowiedzi ostrej fazy na udar. Inne badania u biorców przeszczepu nerki opisują dawki 100 mg podawane codziennie lub co drugi dzień. Należy zachować pewną ostrożność, ponieważ istnieje zwiększone ryzyko infekcji z powodu dodatkowych terapii immunosupresyjnych.

Anakinra jest wydalana z moczem i po podaniu ogólnoustrojowym ma okres półtrwania 4-6 godzin. W opisywanym systemie eksperymentalnym spadek poziomu IL-1RA może być wyjaśniony kombinacją wiązania do celów i wydalania z moczem, chociaż do potwierdzenia tego potrzebne byłyby pomiary w moczu i tkankach.

Systemowe podawanie anakinry badano u pacjentów z przewlekłą niewydolnością nerek. Pacjenci poddawani hemodializie często mają przewlekłe zapalenie, co wiąże się z wyższą śmiertelnością. W randomizowanym badaniu kontrolowanym placebo anakinra, podawana przez obwód hemodializy, zmniejszyła poziom IL-6 w osoczu i białka C-reaktywnego odpowiednio o 25% i 41% w stosunku do wartości wyjściowych.

Anakinra jest również bezpieczna, gdy jest podawana systemowo biorcom przeszczepu nerki w połączeniu ze standardową terapią immunosupresyjną. Nie ma badań u pacjentów po przeszczepieniu nerki badających efekty anakinry. Jednak anakinra była podawana bez działań niepożądanych po przeszczepieniu pacjentom z istniejącymi stanami zapalnymi wywołanymi przez IL-1. Przeszczepienie nerki nieuchronnie wiąże się z uszkodzeniem niedokrwienno-reperfuzyjnym, które może niekorzystnie wpływać na wczesną funkcję przeszczepu. IL-1 jest uwalniana wcześnie po rewaskularyzacji przeszczepu i indukuje zapalenie i apoptozę. W tym kontekście istnieją pewne dowody na to, że endogenny IL-1RA ma ochronny wpływ u pacjentów po przeszczepieniu nerki. Niskie poziomy IL-1RA w surowicy po przeszczepieniu nerki były związane z opóźnioną funkcją przeszczepu, a wyższy poziom IL-1RA w moczu był związany z poprawą rocznej funkcji allograftu.

Jakie perspektywy i wyzwania niesie ze sobą NMP?

Badanie ma kilka ograniczeń. Kombinacja 15 minut ciepłego niedokrwienia i 2 godzin zimnego przechowywania powoduje jedynie łagodny stopień uszkodzenia nerki w tym modelu ex vivo. Nie zastosowano cięższych poziomów uszkodzenia niedokrwiennego, ponieważ znacząco zakłócają one hemodynamikę i funkcję nerek. Wybrano 4-godzinny okres NMP, ponieważ anakinra ma okres półtrwania 4-6 godzin, ale jest to stosunkowo krótki okres do określenia wyniku. Dalsze badania mogłyby zbadać efekty anakinry w cięższym uszkodzeniu niedokrwiennym i podczas dłuższych okresów NMP. Stała infuzja anakinry lub recyrkulacja moczu podczas NMP może zapewnić bardziej stałe dostarczanie leku, szczególnie przez dłuższe okresy. Ponadto więcej informacji można by uzyskać z badań na ludzkich nerkach oferowanych do badań przed przeniesieniem do praktyki klinicznej. Pomogłoby to w opracowaniu protokołów w nerkach ze znacznym upośledzeniem czynności nerek.

Zgłoszono wiele różnych protokołów NMP nerki i nadal brakuje konsensusu co do optymalnych warunków perfuzatu. W tym badaniu użyto pełnej krwi zamiast czerwonych krwinek. Celem było odtworzenie bardziej fizjologicznego środowiska. Niemniej jednak ostatnie badania wykazały, że istnieje niewielka różnica pod względem zmian metabolicznych lub stężeń cytokin zapalnych przy użyciu pełnej krwi lub czerwonych krwinek do NMP.

Ekspresja białka IL-1β nie była wykrywalna w krążącym perfuzacie po 4 godzinach NMP. Może to być wyjaśnione krótkim okresem półtrwania IL-1β w osoczu, który wynosi <5 min, oraz czasem ekspresji w tkance nerkowej, który osiąga szczyt po 1 godzinie. IL-1β przenika przez błonę podstawną kłębuszków i jest prawie całkowicie wchłaniana do komórek kanalików. Dlatego do wykrycia może być wymagane wcześniejsze pobieranie próbek.

Podsumowując, blokada receptora IL-1 skutecznie łagodziła odpowiedź zapalną podczas NMP w nerkach świńskich poddanych łagodnemu urazowi niedokrwiennemu. Badanie to dostarczyło dalszych informacji na temat mechanizmów uszkodzenia nerek podczas NMP i sugeruje, że NMP ma potencjał jako platforma do ukierunkowanego dostarczania leczenia do nerek dawcy przed transplantacją. Niemniej jednak potrzebne są dalsze badania na ludzkich nerkach przed zastosowaniem w praktyce klinicznej.

Podsumowanie

Badanie wykazało, że zastosowanie anakinry podczas normotermicznej perfuzji maszynowej (NMP) skutecznie łagodzi odpowiedź zapalną w nerkach świńskich poddanych łagodnemu urazowi niedokrwiennemu. Kluczowe wnioski obejmują:

1. Anakinra znacząco zmniejszyła ekspresję IL-6, ICAM-1 i ligandu Fas w korze nerki.

2. Nie zaobserwowano negatywnego wpływu na parametry hemodynamiczne i funkcjonalne nerek podczas NMP.

3. Zanotowano znaczące zmniejszenie poziomu IL-6 w moczu w grupie leczonej anakinrą.

4. NMP wykazuje potencjał jako platforma do ukierunkowanego dostarczania leków do nerek dawcy przed transplantacją.

5. Przed wdrożeniem do praktyki klinicznej konieczne są dalsze badania na ludzkich nerkach.

Bibliografia

Hosgood Sarah A., Moore Tom, Walker Alex and Nicholson Michael L.. IL‐1 receptor antagonist anakinra downregulates inflammatory cytokines during renal normothermic machine perfusion: Preliminary results. Artificial Organs 2024, 49(4), 451-459. DOI: https://doi.org/10.1111/aor.14909.